Україна

You are here

Share page with AddThis

Ранньовесняна діагностика фітопатогенів польових культур молекулярними методами, або як бути на крок попереду

Новини компанії
24.04.2019


З усією повагою до агрономічного досвіду наших читачів, важко не погодитись, що діагностика неозброєним оком сьогодні безапеляційно програє новітнім методам виявлення збудників хвороб на рівні ДНК. Метод, який донедавна використовували виключно в медицині та криміналістиці, сьогодні доступний і в сільському господарстві.

Найбільш розповсюдженими та шкодочинними хворобами зернових колосових культур в Україні є борошниста роса, снігова пліснява, тифульоз, бура й жовта іржа злаків, сажкові хвороби, септоріоз, фузаріоз колосу та кореневі гнилі. Їх шкодочинність варіює з року в рік і переважно залежить від погодних умов, загального стану рослин, рівня мінерального живлення, попередника, густоти стояння рослин, сортових особливостей тощо.

Комплекс хвороб уражує рослини на всіх етапах їхнього розвитку, особливо після відновлення вегетації озимими культурами навесні. Через дію низки негативних екологічних факторів (коливання температур, підмерзання, підсихання, хлороз та ін.) пригнічується ріст та розвиток рослин, а згодом на таких послаблених рослинах поселяються різні мікроорганізми (гриби, бактерії та ін.), які зумовлюють розвиток патологічного процесу. В результаті розвивається комплексне захворювання рослин, наприклад кореневі гнилі.

Діагностика вищезгаданих хвороб значною мірою гальмує процес побудови правильних та ефективних систем захисту. Вирішення цих питань ускладнюється ще й тим, що під загальною назвою «кореневі гнилі», крім церкоспорельозу (збудники Helgardia herpotrichoides (Fron) Crous & W. Gams і H. acuformis (Nirenberg) Crous & W. Gams) та офіобольозу (збудник Gaeumannomyces graminis (Sacc.) von Arx & Olivier var. tritici Walker), розглядалося ще чотири хвороби: побуріння основи стебла, або фузаріоз (збудники — гриби роду Fusarium Link); фузаріозна коренева гниль (збудники ті ж самі); звичайна, або гельмінтоспоріозна коренева гниль (збудник Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker) та ризоктоніоз (збудник Rhizoctonia cerealis Van der Hoeven). Усі шість хвороб мають подібні симптоми, тому розрізнити їх візуально майже неможливо.

 

   

Для ефективного застосування засобів захисту рослин від хвороб і контролю зараженості фітопатогенними грибами на різних стадіях розвитку рослинного організму необхідна детекція і точна ідентифікація збудників захворювання. У польових умовах діагностування хвороб, що викликаються фітопатогенними грибами, проводять за наявністю визначених ознак захворювань рослин, а в лабораторних умовах ідентифікацію збудника здійснюють за морфологією спор та іншими ознаками патогену з використанням методів мікроскопії та культивування грибів на поживних середовищах. Однак морфологічні характеристики спор та міцелію грибів у близькоспоріднених видів часто можуть збігатися, крім того, відзначений їх широкий поліморфізм у межах виду. До того ж рослини можуть одночасно уражатися й іншими патогенами, що призводить до спотворення симптомів проявів хвороби. З огляду на це актуальним є застосування більш чутливих методів діагностики. Останніми роками для детекції та ідентифікації фітопатогенних мікроорганізмів використовують як молекулярно‑генетичні методи, так і методи класичної фітопатологічної експертизи.

 

 

Класичні методи діагностики і труднощі в їх застосуванні


Ідентифікація фітопатогенних грибів украй важлива, однак постає запитання: яким чином вона проводиться?

Найпростіший спосіб — це ідентифікація патогену за зовнішніми ознаками захворювання (симптомами), тобто за тим впливом, який він справляє на уражену рослину. Проте тут проблема в тому, що одні й ті ж самі пошкодження рослини‑господаря можуть викликати зовсім різні мікроорганізми, які відрізняються різною стійкістю до фунгіцидів, шкодочинністю та іншими характеристиками. Як приклад можна навести три листові плямистості пшениці (рис. 1).


Рис. 1. Листові плямистості пшениці. Зліва — септоріоз листя пшениці (збудник Mycosphaerella graminicola
(Fuckel) J. Schröt). В центрі — септоріоз листя та колосу пшениці, прояв на листках (збудник Phaeosphaeria
nodorum (E. Müll.) Hedjar). Праворуч — жовта плямистість пшениці (збудник Pyrenophora tritici‑repentis (Died.)
Drechsler). Зверніть увагу: незважаючи на те, що це різні захворювання, ураження листя дуже схожі

Ще одна проблема полягає в тому, що далеко не всі захворювання проявляються відразу ж після зараження рослини. Це так званні латентні, приховані, інфекції, коли тривалий час або й протягом усього життя рослина хворіє без зовнішніх ознак (вірусні хвороби за певних екологічних умов, летюча сажка пшениці, ячменю до фази колосіння та ін.). Наприклад, збудник летючої сажки ячменю (Ustilago nuda (C.N. Jensen) Kellerm. & Swingle) зазвичай проникає під час його цвітіння. Гриб не перешкоджає формуванню зародка, саме зерно розвивається нормально, нічим зовні не відрізняючись від здорового. Гриб зберігається у вигляді міцелію і при проростанні насіння проникає в проростки. У травні‑червні спори, які пиляться з хворих колосків, заражають зав’язь здорових рослин. Водночас руйнуються всі частини колосу, перетворюючись на чорну спорову масу, після розпилення якої залишаються лише ості й стрижень колосу.

Стандартний для фітопатологів підхід при визначенні фітопатогенних грибів — це виділення їх в чисту культуру на будь‑якому живильному середовищі, отримання характерних утворень (найчастіше це спороношення [конідієношення]) і потім ідентифікація методом світлової мікроскопії.

Однак тут виникають певні труднощі. Основна з них полягає в тому, що не всі паразитичні гриби культивуються на штучних поживних середовищах: деяким із них потрібна наявність живих тканин рослини‑господаря або ж специфічних регуляторів росту. Але навіть якщо гриб вдається виділити в культуру, наступним питанням є те, скільки часу знадобиться для появи спороношення? Наприклад, збудник білосолом’яної гнилі пшениці та жита (Gibellina cerealis (Pass.) Pass.) хоч і добре культивується, проте дає спороношення тільки після чотирьох‑п’яти тижнів росту. Зрозуміло, що заходи боротьби з патогеном необхідно вживати відразу після його виявлення, а не через місяць, коли з’ясується, що рятувати вже нічого.

І навіть з визначенням тих фітопатогенних грибів, спороношення яких отримати порівняно просто, можуть виникати складнощі. Приміром, ідентифікація багатьох мікроміцетів пов’язана з низкою труднощів, таких як схожість морфологічних характеристик різних видів і одночасно внутрішньовидова варіабельність ознак. Незважаючи на зовнішню схожість, збудники можуть значно відрізнятися за патогенністю, токсичністю, ступенем спеціалізації, генетикою взаємин із рослиною‑господарем, шкодочинністю, чутливістю до фунгіцидів тощо. Тобто, різні види мають абсолютно різні екологічні потреби та господарську значимість. Яскравим прикладом тут є визначення різних видів роду Alternaria (рис. 2). Очевидно, що для ідентифікації виду потрібні досить широкі пізнання в цій галузі та чималий досвід роботи з досліджування фітопатогенів.


Рис. 2. Порівняння конідій типових зразків Alternaria longipes (Ellis & Everh.) E.W. Mason (вгорі),
Alternaria godetiae (Neerg.) Neerg. (в центрі), Alternaria alternata (Fr.) Keissl. (внизу).
Видно, що на основі порівняння тільки форми конідій цих трьох видів однозначно розрізнити
їх украй складно.  При ідентифікації видів у даному випадку фахівець використовує не тільки форму
конідій, а й інші ознаки, наприклад спосіб їх утворення, взаємне розташування та ін

 

Інноваційні молекулярно-біологічні технології патогенів

Ще два десятиліття тому методи діагностики інфекцій у рослин були досить трудомісткими і займали багато часу. Використання рослин‑індикаторів для ідентифікації вірусів, спеціальних середовищ для виявлення бактерій та інші традиційні методи аналізу займали дні, а в деяких випадках тижні й навіть місяці.

Сучасний метод високоефективного тестування патогенів, в тому числі й фітопатогенів, заснований на полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР). Простота, висока чутливість і специфічність, хороша відтворюваність результатів аналізів швидко перетворили цей підхід на один із найперспективніших діагностичних методів. На відміну від традиційних і серологічних методів аналізу, що дають тільки опосередковане свідчення наявності інфекції (наприклад, відомості про наявність білків‑антигенів діагностованих патогенів), метод ПЛР безпосередньо доводить присутність збудника інфекції, специфічно визначаючи наявність конкретної послідовності нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) виявленого патогену. Крім того, метод ПЛР завдяки своїй високій чутливості дозволяє встановити поодинокі копії геномів патогенів, водночас визначаючи їх наявність тоді, коли іншими методами (імунологічними, бактеріологічними, мікроскопічними) це зробити практично неможливо.

Особливо ефективний метод ПЛР для діагностики важкокультивованих, некультивованих і приховано існуючих форм мікроорганізмів, з якими часто доводиться стикатися при латентних і хронічних інфекціях. ПЛР‑технології, як правило, дозволяють уникнути складнощів, пов’язаних з вирощуванням таких мікроорганізмів у лабораторних умовах. Крім того, використання методу ПЛР дозволяє значно скоротити час аналізу зразка. Для прикладу, фітопатологічний аналіз рослинного матеріалу передбачає 10–14 днів лабораторної експертизи, тоді як отримати результати ПЛР‑діагностики можна протягом 2 робочих днів.

Хоча переваги і перспективи використання молекулярних методів ідентифікації складно переоцінити, на шляху їх практичного застосування виникає ціла низка труднощів. Незважаючи на універсальність методів при кінцевому аналізі, для їх розробки і перевірки потрібно досить багато часу і чимала експериментальна база. Діагностичні центри ТОВ «Сингента» в рамках технічної програми «АгроГід» уже не перший рік надають клієнтам компанії унікальну можливість використовувати ПЛР‑діагностику для вирішення проблем ідентифікації фітопатогенів. Достатньо часто виникають проблеми, пов’язані з необхідністю швидкого визначення етіології симптомів. Це можуть бути як ранні етапи розвитку хвороб, так і фізіологічні реакції рослин на вплив погодних умов, незбалансоване живлення чи прояв фітотоксичності.

Для того щоб скористатися сервісом, вам необхідно відібрати зразок рослинного матеріалу й у максимально короткий час відправити його до Білоцерківського діагностичного центру, де спеціалісти лабораторії проведуть аналіз і нададуть протокол результатів з рекомендаціями від технічних експертів компанії «Сингента».

Для правильного відбору матеріалу використовуйте спеціально розроблені «Рекомендації з відбору зразків для діагностичних центрів» та користуйтеся брендованими пакетами «АгроГід» для рослинного матеріалу, які вам може надати менеджер з продажів компанії «Сингента» у вашому регіоні.

Окрім того, ми рекомендуємо вам стати учасником програми лояльності «АгроЛіга» (agroliga.in.ua) і замовляти сервіси в режимі он‑лайн. Програма дозволяє також відслідковувати статус замовлення, завантаженість діагностичних центрів та зберігати електронні версії протоколів результатів в особистому кабінеті.

Відсутність симптомів ураження — не привід вважати ситуацію в полі контрольованою, а от планування і проведення фітопатологічної експертизи рослин, у тому числі з застосуванням ДНК‑тестування особливо небезпечних для культур збудників, дозволять бути впевненим в очікуваному врожаї.