Україна

You are here

Share page with AddThis

Інноваційні методи в професійному картоплярстві

Новини компанії
13.01.2020

Матеріали взято із журналу «АгроЕліта»

Шевченко Юлія, к.б.н., керівник діагностичних центрів, ТОВ «Сингента»

Грицев Олег, спеціаліст лабораторії Білоцерківського
діагностичного центру, ТОВ «Сингента»


За оцінками Kleffmann Group, 2019 року в Україні промисловими насадженнями картоплі було зайнято 67 тис. га. Попит на українську картоплю у світі значно зріс, зокрема й зі сторони Європейського союзу. Найближчі 5 років ЄС  відчуватиме дефіцит картоплі. Найбільше постраждають переробні підприємства Німеччини та Польщі [за даними УАВК]. Цьогоріч картоплярі отримали «зелене світло» від Брюсселя, але щоб скористатися своїм шансом і вийти на ринок Євросоюзу має бути підтверджено вільні від карантинних організмів ділянки та місця виробництва. Які саме інноваційні методи діагностики вірусних і бактеріальних інфекцій, зокрема карантинних, уже сьогодні використовують у професійному картоплярстві – мова далі.

Картопля через свої біологічні особливості більше, ніж інші сільськогосподарські культури схильна до ураження різними хворобами. Це зумовлено особливостями біологічного розвитку рослини: вегетативне розмноження дає можливість збудникам хвороб існувати в паразитично активній формі як у період вегетації на рослині, так і у період зберігання у бульбах. Циркуляція збудника з року в рік за схемою: бульба – стебло – бульба забезпечує його зберігання у бульбах у латентній формі.

Бактеріальні та вірусні інфекції  порушують нормальний перебіг фізіологічних процесів у рослинах, викликаючи некрози та в’янення, гнилі плодів, що призводить до часткової або повної загибелі рослин. Для мінімізації наслідків вірусних і бактеріальних інфекцій у країнах із високим рівнем розвитку сільського господарства підтримують та вдосконалюють санітарні заходи, які передбачають постійний моніторинг поширення вірусів і збудників бактеріозів і контроль за сертифікацією садивного матеріалу на основі діагностики з метою оздоровлення сортів картоплі.

Україна є членом низки міжнародних організацій, зокрема й Міжнародної конвенції захисту рослин (МКЗР) і Світової організації торгівлі (СОТ). У статті 6 Угоди про застосування санітарних і фітосанітарних заходів, яка є невід’ємною частиною Угоди про заснування СОТ, йдеться про адаптацію до регіональних умов, включаючи зони, вільні від шкідливих організмів або хвороб, та зони з незначною присутністю шкідливих організмів або хвороб.      

Тому, з метою експорту картоплі продовольчої до країн ЄС, у період її вегетації потрібно встановлювати ділянки, вільні від таких шкідливих організмів: гарбузова блішка (Epitrix cucumeris), картопляна блішка (Epitrix turberis), західна картопляна блішка (Epitrix subсrinita), картопляна блішка (Epitrix papa), гватемальська картопляна міль (Tecia solanivora), золотиста картопляна нематода (Globodera rostochiensis), бліда картопляна нематода (Globodera pallida), колумбійська галова нематода (Meloidogyne chitwoodi), коренева галова нематода (Meloidogyne enterolobii), несправжня колумбійська галова нематода (Meloidogyne fallax), несправжня галова нематода (Nacobbus aberrans), нематода-кинджала (Xiphinema rivesi), комовірус андійської плямистості картоплі (Potato Andean mottle comovirus), андійський латентний тимовірус картоплі (Potato Andean latent tymovirus), триховірус Т картоплі (Potato T virus), тосповірус некротичної плямистості бальзаміна (Impatiens necrotic spot virus), альфамовірус пожовтіння картоплі (Potato yellowing alfamovirus), віроїд веретеноподібності бульб картоплі (Potato spindle tuber viroid), веретеновидність клубнів картоплі (Potato spindle tuber viroid), чорний опік (фомозна плямистість) листя картоплі (Phoma andigena), рак картоплі (Synchytrium endobioticum), сажка картоплі (Thecaphora solani (Thirumulachar &), бура гниль картоплі (Ralstonia solanacearum), кільцева гниль картоплі (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicum) [за даними Держпродспоживслужби].

 

Метод ІФА

Ще два десятиліття тому методи діагностики інфекцій рослин були досить трудомісткими та займали багато часу. Використання рослин-індикаторів для ідентифікації вірусів, спеціальних середовищ для виявлення бактерій та інші традиційні методи аналізу займали дні, а інколи й тижні чи місяці.

Основний прорив стався із впровадженням у діагностику методу імуноферментного аналізу (ІФА), одним із найбільш поширених варіантів якого є так званий ELISA-тест (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA). Метод дозволив не тільки збільшити чутливість аналізу, але і скоротити час тестування до декількох годин. ELISA й донині є найбільш поширеним і широко використовуваним методом аналізу рослинного матеріалу для діагностики й ідентифікації патогенів. Для ІФА-тестів використовують цілу низку технологій і модифікацій з використанням кон’югованих з лужною фосфатазою або пірофосфотазою антитіл у так званих прямому методі, подвійному та потрійному сандвічах та ін.

 

Діагностика фітопатогенів методом ІФА добре зарекомендувала себе в широкомасштабних рутинних тестуваннях рослинного матеріалу, однак метод має не завжди задовільну специфічність, діагностуючи часто не окремі патогени, а цілі групи та не дозволяє чітко ідентифікувати конкретні ізоляти та штами. На сьогодні специфічність ІФА значною мірою збільшена, завдяки використанню моноклональних і рекомбінантних антитіл, що забезпечує високу специфічність, хоча чутливість цього методу недостатня для використання у разі детекції ряду латентних бактеріальних інфекцій.

 

Метод ПЛР: високоефективне тестування патогенів

На сьогодні під час аналізу рослинного матеріалу виникає потреба застосування високочутливих і специфічних методів детекції, що дозволяють діагностувати патогени в низькій концентрації, що особливо важливо в разі контролю рослинного матеріалу на наявність карантинних патогенів. Тому на допомогу, а сьогодні все частіше на зміну традиційним і серологічним методам, у практику контролю фітосанітарного стану сільськогосподарських рослин і продуктів їхньої переробки «приходять» молекулярні технології. Це дозволяє значно підвищувати специфічність аналізів і забезпечувати чутливість, яка в 10-100 разів перевищує чутливість ІФА.

Сучасний метод високоефективного тестування патогенів, зокрема і фітопатогенів, ґрунтується на полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР). Простота, висока чутливість і специфічність, хороша відтворюваність результатів аналізів швидко перетворили цей підхід в один із найбільш перспективних діагностичних методів. На відміну від традиційних і серологічних методів аналізу, що дають тільки опосередковане свідчення наявності інфекції (наприклад, відомості про наявність білків-антигенів діагностованих патогенів), метод ПЛР безпосередньо доводить присутність збудника інфекції, специфічно виявляючи наявність конкретної послідовності нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) виявленого патогенна. Ба більше, метод ПЛР, завдяки своїй високій чутливості, дозволяє виявляти поодинокі копії геномів патогенів, тоді як іншими методами (імунологічними, бактеріологічними, мікроскопічними) це зробити практично неможливо.

Особливо ефективний метод ПЛР для діагностики важко культивованих, некультивованих і прихованих форм мікроорганізмів, з якими часто доводиться стикатися у випадку латентних і хронічних інфекцій: ПЛР-технології, як правило, дозволяють уникнути складнощів, пов’язаних із вирощуванням таких мікроорганізмів у лабораторних умовах. До того ж, використання методу ПЛР дозволяє значно скоротити час аналізу зразка. Завдяки автоматизації, процес ампліфікації займає всього 1-2 години, а з урахуванням попередньої пробопідготовки та реєстрації результатів аналізу, весь процес займає не більше 4 годин. До усього вище перерахованого, істотною перевагою методу є можливість здійснювати кількісне визначення збудника в модифікації методу ПЛР у реальному часі.

Висока чутливість ПЛР є як перевагою, так і недоліком методу, створюючи низку проблем, однією з яких є висока ймовірність появи хибнопозитивних і помилково негативних даних. Більше того, коректність проведених ПЛР-тестів значною мірою залежить від адекватності методів виділення нуклеїнових кислот із рослинного матеріалу; чутливість детекції залежить від впливу наявних у рослинному матеріалі інгібіторів ПЛР.

Все це ускладнює процедуру ПЛР-детекції, вимагаючи постановки додаткових контрольних тестів або використання модифікацій методу ПЛР. Для молекулярної діагностики фітопатогенних грибів, вірусів і бактерій застосовують ПЛР у різних її модифікаціях.

Найбільш перспективним для діагностичних лабораторій, які проводять рутинні аналізи, є методи ПЛР у форматі FLASH (Fluorescent Amplification-based Specific Hybridization) або в форматі реального часу. Обидва формати ґрунтуються на флуоресцентній детекції продуктів ампліфікації та дозволяють реєструвати результати ПЛР безпосередньо під час (ПЛР у форматі реального часу) або після проведення реакції (ПЛР у форматі FLASH), без відкривання пробірок. Завдяки цьому уникаємо проблеми контамінації приміщення продуктами ПЛР, спрощуються вимоги до організації ПЛР-лабораторії, значно знижується трудомісткість і час проведення стадії детекції. Методи забезпечують також можливість простої й ефективної документації та зберігання результатів ПЛР у комп’ютерній базі даних.

Резюмуючи вищесказане, варто зазначити, що сучасні, доступні для широкого кола потенційних споживачів технології діагностики й ідентифікації фітопатогенів базуються, в основному, на двох технологіях – ІФА та ПЛР, які постійно удосконалюються щодо чутливості, надійності та простоти застосування. До того ж, сьогодні існує тенденція використання комплексу методів (ring tests), що включають як традиційні (мікроскопія, селективні середовища, тести на патогенність і т.п.), так і сучасні серологічні та молекулярні тести. Діагностика фітопатогенів, як власне і будь-яких інших об’єктів, набуває рис динамічного зростання і постійно еволюціонує.

Таблиця 1. Ідентифікація збудників вірусних і бактеріальних інфекцій картоплі методами ІФА та ПЛР

Хоча переваги та перспективи використання молекулярних методів ідентифікації складно переоцінити, на шляху їхнього практичного застосування виникає ціла низка труднощів. Незважаючи на універсальність методів при кінцевому аналізі, для їхньої розробки та перевірки потрібно досить багато часу та чимала експериментальна база. Білоцерківський діагностичний центр у рамках технічної програми вже не перший рік надає клієнтам компанії «Сингента» унікальну можливість використовувати ІФА- та ПЛР‑діагностику для вирішення проблем ідентифікації фітопатогенів (Таб. 1). Серед майбутніх планів розвитку технічної сервісної програми на базі Білоцерківського діагностичного центру є повний перехід на більш прогресивні методи молекулярної діагностики – ПЛР-аналіз, зокрема й у режимі реального часу та з можливістю кількісної оцінки збудника.

Достатньо часто виникають проблеми, пов’язані з необхідністю швидкого визначення етіології симптомів у період вегетації культури. Це можуть бути як ранні етапи розвитку хвороб, так і фізіологічні реакції рослин на вплив погодних умов, незбалансоване живлення чи прояв фітотоксичності. Недооцінене накопичення вірусної та бактеріальної інфекції у посадковому матеріалі призводить до суттєвих втрат урожаю. Потенційні втрати від поєднання вірусів у бульбах в окремі роки становили до 70% недобору врожаю (Рис. 1.)

 

Рис.1. Зниження урожайності з наростанням первинного вірусного зараження рослин

 

Відсутність симптомів ураження – не привід вважати ситуацію в полі контрольованою, а посадковий матеріал якісним. Планування і проведення фітопатологічної експертизи рослин, зокрема зі застосуванням ІФА- та ДНК‑тестування особливо небезпечних для культур збудників, дозволять бути впевненим в очікуваному врожаї.